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Anesthésie et chirurgie d’un chromosome cassé visualisé en temps réel

by Frédéric Magné - published on

Un outil pour visualiser et étudier in vivo la dynamique de portions de chromosome en dérivant un système bactérien pour son utilisation dans les cellules eucaryotes a été développé par des chercheurs du Laboratoire de microbiologie et de génétique moléculaires (CNRS/Université Toulouse III – Paul Sabatier) et le Laboratoire de biologie moléculaire eucaryote (CNRS/Université Toulouse III – Paul Sabatier).
 

Cet outil repose sur l’insertion aisée de courtes séquences bactériennes dans le génome de cellules eucaryotes qui expriment une protéine fluorescente reconnaissant spécifiquement ces séquences. L’association de cette protéine avec sa séquence cible provoque le recrutement d’autres protéines par oligomérisation. L’augmentation de la concentration locale en protéines fluorescentes sur cette région entraîne la création d’un signal fluorescent facilement détectable par microscopie sur cellules vivantes. L’atout majeur de cet outil repose sur plusieurs points. Tout d’abord, la taille grandement réduite de l’insertion génomique, 1kb, par rapport aux autres outils disponibles, supérieurs à 10kb, facilite sa manipulation et son insertion dans le génome. Sa nature non répétée la rend permissive vis-à-vis des processus utilisant l’ADN et lui procure une stabilité accrue. En effet, la liaison de la protéine fluorescente sur sa séquence cible n’est pas figée et la protéine est facilement déplacée de son locus en cas de perte de sa séquence cible.

Les chercheurs ont inséré leur balise fluorescente à proximité immédiate d’un site inductible de cassure double brin de l’ADN. Lors de l’induction de la cassure, le focus fluorescent créé par leur outil disparaît rapidement. Ce phénomène reflète la dégradation exonucléolytique que subit l’ADN lors de la maturation des extrémités de la cassure. Cette dégradation, aussi connue sous le nom de résection, est un des processus les plus précoces dans le métabolisme des cassures. Il est essentiel pour la réparation des chromosomes par recombinaison homologue. La délétion d’un facteur cellulaire limitant cette étape de résection, yKu, accélère ce mécanisme de manière spectaculaire. La réponse quantitative à la modification de processus impliqués dans la résection, ouvre la porte pour l’identification d’autres facteurs primordiaux dans la réparation de l’ADN. De plus, alors qu’il était jusqu’alors impossible de déterminer le moment précis de la prise en charge d’une cassure dans les cellules vivantes, il a été observé que la mobilité des chromosomes suite à la cassure est rapidement réduite, et ce de manière transitoire. Ce confinement contribue probablement à la mise en place de la machinerie de résection et de réparation avant d’engager la recherche d’une séquence homologue. L’application de cette nouvelle méthode offre des perspectives uniques dans la recherche de facteurs modifiant les capacités de réparation des cellules, et plus largement dans toutes les fonctions ayant attrait à l’ADN comme la régulation de la transcription avec des applications nouvelles dans le domaine biomédical.

Figure : Illustration des systèmes de marquage d’ADN INT et images de microscopie de cellules de levures qui resectent les extremités de la cassure.
A gauche : afin de marquer une région chromosomique par le système parB/INT, il suffit d’intégrer la courte séquence d’ADN INT au locus génomique d’interet. Les protéines ParB1-mCherry et ParB2-GFP exprimées pas la cellule se fixent spécifiquement à INT et s’étalent autour. Ici on a marqué la région d’ADN à proximité d’un site de cassure double brin inductible par INT1. Après addition de galactose (étape : +Gal), la cassure est générée dans HO et la résection (conversion en simple brin) de l’ADN autour de la cassure sera déclenchée. La disparition des séquences INT entraine la disparition du focus INT1/ParB1-mcherry rouge permettant ainsi d’identifier les cellules uniques subissant un dommage à l’ADN.

A droite en haut : Visualisation des levures avec des régions d’ADN marquées par INT par microscopie en 3D et à fluorescence.
A droite en bas : Une levure marquée par INT1/ParB1-mCherry et INT2/ParB2-GFP. Le groupement des protéines autour des séquences INT formera un focus rouge pour INT1/ParB1-mCherry et vert pour INT2/ParB2-GFP. Le temps indiqué est celui après la cassure. Le focus rouge disparait à 14 minutes, le vert persiste. Les contrôles effectués démontrent que cette disparition du point fluorescent est due á la résection de INT-1 qui est convertie de double brin en simple brin. La barre d’échelle (en jaune) est de 2 micromètres.© Bystricky/CNRS

 

 Référence

"DNA Dynamics during Early Double-Strand Break Processing Revealed by Non-Intrusive Imaging of Living Cells" , Hicham Saad, Franck Gallardo, Mathieu Dalvai, Nicolas Tanguy-le-Gac, David Lane & Kerstin Bystricky, Plos Genetics (2014)

 

Contact chercheurs

Kerstin Bystricky

UNIVERSITE TOULOUSE 3 - PAUL SABATIER
Bât IBCG
118 Route de Narbonne
31062 TOULOUSE CEDEX 4
Mél. : kerstin.bystricky@ibcg.biotoul.fr